Multiplex pcr là gì? Các công bố khoa học về Multiplex pcr

Việc đặc trưng đầy đủ vi khuẩn kháng methicillin Staphylococcus aureus (MRSA) không chỉ yêu cầu xác định nền gen vi khuẩn mà còn cả cấu trúc của yếu tố phức tạp và dị hợp tử mec mà các vi khuẩn này mang, yếu tố này liên quan đến gen xác định tính kháng thuốc mecA. Chúng tôi báo cáo về sự phát triển, xác thực và ứng dụng của một chiến lược PCR đa mảnh cho phép đặc trưng sơ bộ nhanh chóng các loại yếu tố mec dựa trên các đặc điểm cấu trúc đã được chứng minh là điển hình của các yếu tố mec mang bởi nhiều chủng MRSA. Chiến lược này đã được xác thực bằng cách sử dụng một bộ sưu tập đại diện của các chủng MRSA đại dịch, trong đó đầy đủ cấu trúc của các yếu tố mec liên quan đã được xác định trước đó bằng cách lai ghép và sàng lọc PCR cũng như bằng phương pháp giải trình tự DNA. Phương pháp này đã được kiểm tra cùng với phương pháp phân loại theo nhiều locus và các phương pháp phân loại khác để đặc trưng hóa 18 mẫu đại diện cho các chủng MRSA thu thập được trong một đợt bùng phát tại bệnh viện ở Barcelona, Tây Ban Nha. PCR đa mảnh đã được chứng minh là nhanh chóng, đáng tin cậy, và có khả năng trong một thử nghiệm xác định năm loại cấu trúc của yếu tố mec giữa các chủng này, ba biến thể chính và hai biến thể phụ, mỗi loại đều đã được phát hiện trong các nghiên cứu kháng MRSA trước đây. Kỹ thuật này có thể là một bổ sung hữu ích cho kho vũ khí các công cụ phân loại phân tử dùng cho việc đặc trưng các loại clonal MRSA và nhận diện nhanh chóng các biến thể cấu trúc của yếu tố mec.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả một phương pháp thử nghiệm multiplex PCR để phát hiện chín gene kháng kháng sinh có liên quan lâm sàng củaStaphylococcus aureus. Các điều kiện đã được tối ưu hóa để khuếch đại các đoạn củamecA (mã hóa khả năng kháng methicillin),aacA-aphD (kháng aminoglycoside),tetK,tetM (kháng tetracycline),erm (A),erm (C) (kháng macrolide-lincosamide-streptogramin B),vat (A),vat (B), vàvat (C) (kháng streptogramin A) đồng thời trong một lần khuếch đại PCR. Một cặp mồi bổ sung để khuếch đại một đoạn của 16S rDNA của vi khuẩn tụ cầu đã được đưa vào như một đối chứng dương tính. Phương pháp multiplex PCR đã được đánh giá trên 30 chủng khác nhau củaS. aureus, và các kết quả PCR tương quan với dữ liệu kháng kháng sinh kiểu hình thu được từ phương pháp pha loãng vi sinh trong môi trường. Phương pháp multiplex PCR cung cấp một phương pháp nhận diện nhanh chóng, đơn giản và chính xác về các mẫu kháng kháng sinh và có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng cũng như để giám sát sự lây lan của các yếu tố xác định kháng kháng sinh trong các nghiên cứu dịch tễ học.

Việc phân loại gen gắn với chromosome của vi khuẩn Staphylococcus aureus mang yếu tố kháng methicillin (SCC mec ) là rất quan trọng cho việc xác định và phân loại các dòng vi khuẩn kháng methicillin. Đối với các mục đích thông thường, phương pháp PCR đa dạng (multiplex PCR) là phương pháp phù hợp nhất cho việc phân loại SCC mec . Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày một bản cập nhật cho chiến lược PCR đa dạng cho phân loại SCC mec mà chúng tôi đã mô tả vào năm 2002, nhằm đảm bảo các kiểu SCC mec loại IV và V có thể được xác định chính xác.

Một thử nghiệm PCR đa mảnh đã được sử dụng để phát hiện đồng thời các gen từ năm loại vi khuẩn Campylobacter có liên quan lâm sàng chính. Các gen được chọn là hipO và 23S rRNA từ Campylobacter jejuni; glyA từ từng loại C. coli, C. lari, và C. upsaliensis; và sapB2 từ C. fetus phụ fetus. Thử nghiệm đã được đánh giá với 137 mẫu lấy từ lâm sàng và môi trường, và cho thấy là nhanh chóng và dễ thực hiện, đồng thời có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phân loại các mẫu, ngay cả trong các văn hóa hỗn hợp.

Một phương pháp xét nghiệm PCR phát huỳnh quang (TaqMan) đã được phát triển để phát hiện các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Hai đầu dò phát huỳnh quang đã được sử dụng trong một phản ứng đa mã: một đầu dò RS có phạm vi rộng để phát hiện tất cả các biovar của R. solanacearum và một đầu dò B2 đặc hiệu hơn để phát hiện chỉ biovar 2A. Quá trình khuếch đại mục tiêu được đo lường thông qua hoạt động nuclease tại 5′ của Taq DNA polymerase trên từng đầu dò, dẫn đến phát xạ huỳnh quang. PCR TaqMan đã được thực hiện với DNA chiết xuất từ 42 dòng R. solanacearum và các dòng có liên quan về mặt di truyền hoặc huyết thanh học để chứng minh tính đặc thù của xét nghiệm. Trong các môi trường nuôi cấy tinh khiết, R. solanacearum có thể được phát hiện ở mức độ ≥10² tế bào ml⁻¹. Độ nhạy giảm khi xét nghiệm PCR TaqMan được thực hiện với các chiết xuất từ mô khoai tây được tiêm chủng, chuẩn bị theo các quy trình chiết xuất hiện được khuyến cáo. Một đầu dò phát huỳnh quang thứ ba (COX), được thiết kế sử dụng trình tự gen cytochrome oxidase của khoai tây, cũng đã được phát triển để sử dụng như một kiểm soát nội bộ PCR và đã được chứng minh để phát hiện DNA khoai tây trong PCR TaqMan multiplex RS-COX với mô khoai tây bị nhiễm. Tính đặc thù và độ nhạy của xét nghiệm, kết hợp với tốc độ cao, bền bỉ, độ tin cậy và khả năng tự động hóa, mang lại những lợi thế tiềm năng trong việc định danh thường kỳ của củ khoai tây và các vật liệu thực vật khác nhằm phát hiện sự hiện diện của R. solanacearum.

Các chủng phân lập lâm sàng của Staphylococcus aureus (tổng cộng 206) và S. epidermidis (tổng cộng 188) từ nhiều quốc gia đã được thử nghiệm bằng các phương pháp PCR đa dạng để phát hiện các gen kháng sinh có liên quan lâm sàng liên quan đến staphylococci. Các gen mục tiêu liên quan đến khả năng kháng lại oxacillin ( mecA ), gentamicin [ aac (6′)- aph (2")], và erythromycin ( ermA , ermB , ermC , và msrA ). Chúng tôi đã tìm thấy sự tương quan gần như hoàn hảo giữa phân tích genotyp và phenotyp cho hầu hết 394 chủng này, cho thấy các mối tương quan sau đây: 98% đối với kháng thuốc oxacillin, 100% đối với kháng thuốc gentamicin, và 98.5% đối với kháng thuốc erythromycin. Các kết quả không nhất quán là (i) tám chủng được xác định dương tính bằng PCR cho mecA hoặc ermC nhưng nhạy cảm với kháng sinh tương ứng dựa trên khuếch tán đĩa và (ii) sáu chủng của S. aureus được xác định âm tính bằng PCR cho mecA hoặc cho bốn gen kháng thuốc erythromycin được lựa chọn nhưng lại kháng với kháng sinh tương ứng. Để chứng minh in vitro rằng tám chủng nhạy cảm mang gen kháng thuốc có thể trở nên kháng thuốc, chúng tôi đã cấy lại các chủng nhạy cảm trên môi trường với các gradient tăng dần của kháng sinh. Chúng tôi đã có thể chọn lọc các tế bào thể hiện kiểu hình kháng thuốc cho tất cả tám chủng này mang gen kháng dựa trên khuếch tán đĩa và xác định MIC. Bốn chủng kháng oxacillin âm tính với mecA đã dương tính với PCR cho blaZ và có kiểu hình của những người sản xuất β-lactamase siêu, điều này giải thích kiểu hình kháng oxacillin ở ngưỡng của chúng. Kháng erythromycin cho hai chủng được xác định âm tính bằng PCR có thể liên quan đến một cơ chế mới. Nghiên cứu này nhấn mạnh sự hữu ích của các xét nghiệm dựa trên DNA để phát hiện các gen kháng thuốc kháng sinh liên quan đến nhiễm trùng staphylococcal.